一直以来，为了提高农业产量，农药被大量应用于防治病虫害和促进作物生产。目前，针对农药的检测方法多以仪器分析方法为主，如光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、核磁共振法等。如今越来越多的研究团队基于生物学原理建立了许多相关检测技术，如生物毒性试验法、免疫法、酶化学法、生物传感器法等。这类方法不需要大型设备，因此更便于携带，同时检测速度快、成本低廉，可以用作精密仪器分析方法的补充，有效降低检测成本、提高检测效率。

　　发光细菌作为典型的生物毒性试验生物，是一类能够发射出可见荧光的非致病性的革兰氏阴性菌，其发出的可见蓝绿色荧光波长在490 nm左右，发光强度与有毒有害物质的含量相关。发光细菌及生物工程菌检测法作为一种污染检测的快速初筛方法，前处理简单、成本低廉，在定性、半定量的现场快速检测中具有优势。

　　西北农林科技大学食品科学与工程学院彭悦、文春露、丁武*等人将指示生物青海弧菌Q67（Vibrio qinghaiensis sp. Q67）作为测试菌种，选择5 种在蔬菜、水果以及水体等中常被报道的残留有机磷类、氨基甲酸酯类农药为研究对象，测定5 种农药对青海弧菌Q67的急性毒性效应，聚焦多种农药共存时混合体系对青海弧菌Q67的联合毒性效应，并通过相关数学模型进行评价及预测其作用规律。

　　从图2中能够看出，发光抑制率与不同农药的质量浓度呈正相关。表3中列出了各农药的线性回归方程、决定系数（R2）和EC50。根据拟合结果可知，PIR、CAR、GLY、DIM、ACE的EC50（及其95%置信区间）分别为33.2（29.8～36.6 mg/L）、43.9（40.5～47.4 mg/L）、40.7（36.8～46.0 mg/L）、265.7（246.2～277.6 mg/L）、562.7（519.5～607.0 mg/L）mg/L。EC50越小，该农药对发光细菌的毒性就越大。综上可知，5 种农药的急性毒性顺序为PIR＞GLY＞CAR＞DIM＞ACE。实验中发现在低质量浓度条件下，存在发光抑制率小于零的情况。这是由于存在兴奋效应，即低剂量致毒因素对生物体有益，可刺激发光微生物发光。

　　从5 种农药的化学结构（图1）可知，PIR和CAR作为毒性较大的两种农药，都含有六元环结构。ACE在本研究中毒性最小，这可能是由于其水溶性最好、脂溶性最差，因而对细胞膜的破坏性最小。

　　二元混合物联合毒性的剂量-反应关系如图3所示。由公式（2）可知，TUmix随着各组分质量浓度的增加而增加，因此可以得知，IR与不同的二元混合物的质量浓度均呈正相关关系。表4列出了二元混合物的拟合方程、R2和EC50。根据TU模型及其评价方法，TUmix＜0.8，混合体系联合毒性呈协同作用；0.8＜TUmix＜1.2，联合毒性为加和作用；TUmix＞1.2，联合毒性为拮抗作用。因此，10 组二元混合物的急性毒性依次为：PIR＋DIM＞CAR＋DIM＞CAR＋GLY＞PIR＋GLY＞CAR＋ACE＞PIR＋ACE＞GLY＋ACE＞GLY＋DIM＞PIR＋CAR＞DIM＋ACE。其中PIR＋DIM、CAR＋DIM呈协同效应，CAR＋GLY、PIR＋GLY、CAR＋ACE、PIR＋ACE的联合毒性效应呈简单加和作用，GLY＋ACE、GLY＋DIM、PIR＋CAR、DIM＋ACE的联合毒性效应皆呈拮抗作用。

　　PIR、CAR均为氨基甲酸酯类农药，而GLY、DIM和ACE为有机磷类农药，根据本研究推测同种类的农药与青海弧菌Q67的结合位点和破坏方式高度一致，因此同类农药间混合时存在竞争关系，从而导致联合毒性呈拮抗效应。其余二元组合则由于多种毒性物质混合后，联合毒性呈现加和或协同作用。

　　已有研究表明，至少含有3 种成分的混合物组合才会产生时间依赖性毒性。因此，本研究针对五元混合体系设置了15、30、45、60 min 4 个时间点进行毒性效应评价。运用CA模型评价体系毒性效应，如图4所示，R1、R3、R5、R6射线 min内为低质量浓度下协同作用，高质量浓度下拮抗作用，45～60 min范围内无论质量浓度大小毒性均为拮抗作用，存在一定的时间依赖性；R2、R4、R7射线 min内联合毒性始终呈拮抗作用，不随质量浓度和时间改变，毒性不存在时间依赖性。

　　从五元混合体系联合毒性的结果中可以看出，部分多元组合的联合毒性与暴露时间呈正相关，为低质量浓度加和作用与高质量浓度拮抗作用。整体来看，随着质量浓度的增加，联合毒性效应最终都会呈现拮抗作用，这可能是由于这几种农药作用于青海弧菌Q67内一个或几个相同的靶点，且农药之间存在竞争关系。混合物中各组分的剂量效应曲线类型相同，毒性作用模式也接近，与青海弧菌Q67结合的点位也相同，当混合物中各组分质量浓度达到一定程度时，青海弧菌Q67可供结合作用点位成为相对稀缺的资源，因此混合物毒性作用方式开始出现拮抗关系。

　　为探究混合物的联合毒性是否可能与体系中某一组分的浓度比例有关，本研究将7 条混合物射线的浓度比（Pi）与混合物体系的pEC50（EC50的负对数）进行线性拟合，发现CAR的浓度比例始终与混合体系的毒性相关性最高，暴露15 min时PIR、CAR、GLY、DIM和ACE浓度比的拟合方程如式（5）～（9）所示。

　　从上述公式中可以看出，CAR浓度比与五元混合体系的pEC50呈负相关关系，则说明混合体系的总毒性与CAR浓度比具有良好的正相关性（r＝0.947）。此外，混合体系总毒性与ACE浓度比具有一定的相关性，与DIM、PIR浓度比具有较小的相关性，与GLY浓度比几乎不具有相关性。这一结果也与张瑾等的结论相类似，说明影响混合体系毒性的最关键组分很可能是毒性较大的物质，但不一定取决于毒性最大的组分。

　　将混合物射线 与组分CAR浓度比之间进行线性拟合，并将拟合结果与CA模型结果进行比较，如图5所示，线性拟合的预测值几乎都在实验观测值的95%置信区间内，这说明CAR的浓度比和五元混合体系毒性的这种线性拟合具有良好的预测能力，可以用于评估农药混和体系中的毒性相互作用，或可成为混合物毒性评估的一种新途径。

　　此外，农药与细菌接触后，会对细菌造成不同程度的损伤。青海弧菌Q67在农药或抗生素胁迫下细胞形态会发生明显变化：农药或抗生素使青海弧菌Q67细胞相互结合，破坏细菌的膜结构；使青海弧菌Q67细胞变长，导致细胞破裂；不破坏细胞形态，仅抑制发光。化学物质对细菌产生毒性的机理通常被认为有以下几种途径：影响细胞的结构、对酶活性产生影响、对生物大分子的结构与功能形成干扰（如DNA、蛋白质等）；存在竞争位点；鳌合或络合及沉淀作用。

　　本研究发现，5 种农药的毒性大小顺序为PIR＞GLY＞CAR＞DIM＞ACE，EC 50 依次为33.2、40.7、43.9、265.7、562.7 mg/L。10 组二元混合物的急性毒性大小按顺序为PIR＋DIM＞CAR＋DIM＞CAR＋GLY＞PIR＋GLY＞CAR＋ACE＞PIR＋ACE＞GLY＋ACE＞GLY＋DIM＞PIR＋CAR＞DIM＋ACE。其中GLY＋ACE、GLY＋DIM、PIR＋CAR、DIM＋ACE 4 组呈拮抗效应，PIR＋DIM、CAR＋DIM呈协同效应，其余4 组皆呈加和作用。7 组五元混合物中4 组呈现先协同后拮抗的作用趋势（R1、R3、R5、R6），3 组始终呈拮抗作用（R2、R4、R7），且总体毒性与组分CAR的浓度比呈良好的正相关关系（r＝0.947）。因此本研究中可通过关键组分CAR的浓度比初步判断五元混合体系的毒性。

　　在实际的生产生活中，通常为多种农药混用，从本研究可以看出，农药混合溶液在高浓度下一般呈拮抗作用，除草杀虫的效果反而有可能下降。因此，混配农药时要注意混用比例与浓度。同时，随着多种农药混合时间的延长，拮抗效果常出现前移，即低质量浓度下农药溶液也开始呈现拮抗效应。通过单一农药毒性的拟合曲线反函数可计算出，青海弧菌Q67对于各农药在国标中的最大残留限量下同样存在不同程度的发光响应度（IR PIR ：8.80%；IR CAR ：4.50%；IR GLY ：－5.46%；IR DIM ：－3.04%；IR ACE ：－5.95%），可考虑进一步建立完整的毒性模型，从目前的定性半定量转变为定性的同时也实现定量目的。综上所述，本研究可作为一种潜在的复杂体系中食品安全因素初筛方法，由于其成本低廉、检测速度快、操作简便、便于携带的优点，可为检测人员和执法人员带来便利，也更加适合流通速度快的食品行业，并可为快速检测提供新的方法和思路。

　　本文《利用青海弧菌Q67评估5 种农药的毒性作用》来源于《食品科学》2023年44卷第9期15-24页，作者：彭悦，文春露，杨春杰，蒋圣启，丁武。DOI:10.7506/spkx0411-123。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息

　　实习编辑：渤海大学食品科学与工程学院 王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及百度。

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